Actividad antiplasmodial y antibacterial in vitro
de extractos de la corteza de Erythrina fusca Lour. (Fabaceae)
Antiplasmodial and antibacterial in
vitro activity from extracts the bark of Erythrina fusca Lour.
(Fabaceae)
Donys Jiménez-Acosta1, 4, Rita Márquez-Vizcaíno1, 5, Catalino
de la Rosa-Torres2, 6,
Adriana Pabón-Vidal3, 7
Resumen
El tamizaje fitoquímico del extracto en etanol de la corteza seca de Erythrina fusca Lour. (Fabaceae), determinó la
presencia de alcaloides,
flavonoides, terpenos y quinonas. Las
fracciones en cloroformo y acetona del extracto en etanol de la corteza seca de
E. fusca, presentaron actividad
antiplasmodial in vitro en las cepas NF54 y FCB-2 de Plasmodium falciparum, con concentración inhibitoria (IC50)
de 12,95, 18,02, 16,60 y 28,36 µg/ml y
porcentajes de inhibición promedio máximo de 70,72, 69,74, 87,07 y 85,73%, respectivamente.
El extracto en etanol mostró efecto
antibacteriano in vitro a la
concentración de 20 mg/ml sobre la cepa de Staphylococcus aureus y la fracción en cloroformo a la misma concentración
sobre Bacillus subtilis,
Pseudomona aeruginosa y Staphylococcus
aureus.
Palabras clave: Bacillus subtilis, Erythrina
fusca, Plasmodium falciparum, Pseudomona aeruginosa, Staphylococcus aureus
Abstract
The phytochemical screening of ethanol extract of the dried bark of Erythrina fusca Lour. (Fabaceae), determined the presence of alkaloids,
flavonoids, terpenes, and quinones. The chloroform and acetone fractions of
ethanol extract of the dried bark of E. fusca, presented
a moderate antiplasmodial activity in NF54 and FCB-2
strains of Plasmodium falciparum with IC50 of 12.95, 18.02,
16.60, and 28.36 µg/ml, and a percentages inhibition of maximum average 70.72,
69.74, 87.07, and 85.73%, respectively. The ethanol extract showed inhibition
at the concentration of 20 mg/ml for the strain of Staphylococcus aureus
and chloroform fraction at the same concentration on Bacillus subtilis, Pseudomona aeruginosa, and Staphylococcus
aureus.
Key words: Bacillus subtilis,
Plasmodium falciparum, Pseudomona aeruginosa,
Staphylococcus aureus
INTRODUCCIÓN
La Organización
Mundial de la Salud (OMS), registró
que en el año 2013 se presentaron a nivel mundial 198 millones de casos
clínicos de malaria, de los cuales 584.000 fueron mortales. Además, informó que
3.200 millones de personas viven en regiones de alto riesgo para su
transmisión, lo que hace de esta enfermedad la principal causa de morbilidad y
mortalidad en más de 90 países ubicados en las regiones tropicales y
subtropicales del mundo, especialmente en la región al sur del Sahara en
África, el sudeste de Asia y Latinoamérica (WHO 2014). Esta enfermedad
infecciosa es producida por parásitos del género Plasmodium; su tratamiento ha sido realizado con diversos medicamentos que
actúan sobre los estadíos eritrocíticos
del parásito, entre los cuales se encuentra la quinina, un alcaloide aislado a
partir de especies del género Cinchona (Rubiaceae) y otros
derivados sintéticos desarrollados posteriormente que han mostrado ser más
efectivos, menos tóxicos y de bajo costo (Arango et al. 2006).
La resistencia
de los Plasmodium
a los fármacos comúnmente utilizados para el tratamiento, se constituye en uno
de los principales obstáculos para el control de la enfermedad en muchas partes
del mundo (Carrillo y Díaz 2005). Por ello, es necesario desarrollar nuevas
sustancias con mayor efectividad antiparasitaria y con menos efectos adversos,
recurriendo de esta manera a la investigación en productos naturales apoyada en
los conocimientos tradicionales, que distintos grupos humanos han acumulado a
lo largo de generaciones, sobre los efectos curativos de las plantas (Taborda y Cuca 2005). De esta forma, el reconocimiento y
validación de la medicina tradicional con toda su carga de experiencia
práctica, tradiciones, usos y costumbres, pueden conducir al desarrollo de nuevos
medicamentos antimaláricos derivados de plantas. Por
lo tanto, aquellas plantas que presentan mayor frecuencia de uso en la medicina
tradicional por sus propiedades antimaláricas, deben
ser estudiadas con el fin de determinar su eficacia y evaluar su potencial como
fuente importante de nuevos medicamentos (Carrillo y Díaz 2005).
El género Erythrina (Fabaceae), ha sido ampliamente usado en la medicina
tradicional para el tratamiento de varias enfermedades, especialmente
infecciones microbianas (Pillay et al. 2001). Estas
plantas son conocidas por ser una fuente rica de alcaloides bioactivos
(Pino et al. 2004), flavonoides, flavonas, isoflavonas
y pterocarpanos (Chacha et al. 2005). Algunos de
estos flavonoides encontrados exponen una variedad de actividades biológicas,
como antimicrobiana (Chacha et al. 2005, Sato et al. 2003, Tanaka
et al. 2002, Yenesew et al. 2005), anti-inflamatoria
(Njamen et al. 2003) y antiplasmodial
(Andayi et al. 2006).
Por otra parte,
con base en la gran diversidad de estas especies vegetales, las cuales pueden
poseer amplio potencial bioquímico, es importante valorar su efecto biológico
por medio de la investigación, ya que muchas plantas contienen sustancias que
podrían permitir nuevos usos, especialmente en la medicina (Campos et al.
2005), en el tratamiento de muchas enfermedades como las transmitidas por
vectores. La búsqueda de nuevas fuentes en estas sustancias, preferiblemente de
origen vegetal, se ha convertido en un reto para la comunidad científica,
porque además de aprovechar de modo razonable los recursos naturales, ayudaría
a mejorar las condiciones de vida (Puertas et al. 2009).
Dada la
efectividad que tienen las plantas del género Erythrina como fuente medicinal,
se planteó investigar con el propósito de documentar la importancia relativa de
esta especie vegetal y contribuir al conocimiento de la flora propia de la
región; razón por la cual se evaluó la actividad antiplasmodial
y antibacterial in vitro del extracto en etanol y fracciones de la corteza seca de Erythrina fusca Lour. contra parásitos intracelulares de Plasmodium falciparum resistentes y sensibles a cloroquina y bacterias Gram positivas Bacillus
subtilis y Staphylococcus aureus, y Gram negativas Pseudomona aeruginosa.
MATERIALES Y MÉTODOS
Recolección
del material vegetal. El material vegetal
(corteza), fue recolectado en el campus de la Universidad de Sucre sede puerta
roja, área urbana de la ciudad de Sincelejo, a 212 m. s. n. m. con una
temperatura media de 28 °C. La recolección se realizó durante la época de
floración (enero-febrero), en horas de la tarde. La especie vegetal fue identificada como Erythrina fusca Loureiro; un ejemplar se encuentra depositado en el Herbario de la
Universidad de Sucre bajo el número 364798. El material vegetal en buen estado
fue seleccionado, secado a temperatura ambiente durante 15 días y posteriormente
sometido a un proceso de molienda.
Proceso de extracción. Se extrajeron por percolación 500 g del material vegetal
(corteza) seca y molida con etanol al 96% a temperatura ambiente durante 8
días. El extracto obtenido fue filtrado y concentrado a presión reducida y
secado al vacío sin calor (Mesa et al. 2007).
Identificación cualitativa de metabolitos secundarios. El reconocimiento de los metabolitos secundarios
presentes se realizó tomando 10 g de extracto seco y otros 15 g de extracto
fueron sometidos a extracción sólido-líquido con cloroformo y acetona obteniéndose dos fracciones, las
cuales fueron monitoreadas por cromatografía en capa delgada revelando las
placas con una solución de vainillina/H2SO4 (Mesa et al.
2007).
Ensayo de citotoxicidad. El extracto y fracciones fueron
evaluados por el micrométodo enzimático MTT bromuro de 3-(4,5
dimetiliazol-2-il)-2-5-difeniltetrazolio
en células promonocíticas humanas U-937, siguiendo la metodología descrita por Mosmann
(1983), el cual revela daños celulares a nivel mitocondrial. El MTT que es de
color amarillo es reducido por las células metabólicamente activas, en parte
por la acción de enzimas deshidrogenasas, generando equivalente reducidos tales
como NADH y NADPH que dan como resultado la formación de cristales de formazán,
un compuesto de coloración violeta que es solubilizado y cuantificado por
espectrofotometría a 570 nm. El ensayo fue realizado por triplicado, y los
resultados se analizaron con el programa estadístico Graphpad Prisma para
obtener las concentraciones citóxicas 50 (CC50).
Actividad
antiplasmodial. Se determinó la actividad antiplasmodial
del extracto y de las fracciones de acuerdo al método de fluorescencia con SYBR GREEN (Smilkstein et al. 2004). Las cepas
del parásito P. falciparum fueron
cultivadas siguiendo el método descrito por Trager y Jensen (1976) y modificado
por el grupo de investigación Malaria de la Universidad de Antioquia (2004). La fluorescencia se midió en un espectrofluorómetro
(excitación 485 nm y emisión 538 nm).
El resultado de la actividad antiplasmodial se
determinó mediante el cálculo del porcentaje de inhibición del crecimiento de
los parásitos para cada concentración de los extractos. La concentración
inhibitoria del 50% (IC50;
concentración que inhibe el 50% del crecimiento de los parásitos) se calculó
con el programa Graphpad Prism
versión 5.0.
Evaluación
de la actividad antibacterial. Una vez realizada
la prueba de sensibilidad de los microorganismos Bacillus subtilis, Pseudomona aeruginosa y Staphylococcus aureus (cepas ATCC) frente a extracto y fracciones, se
determinó la actividad antibacterial por el método de difusión en agar, evaluando
las concentraciones de 5, 20, 40 y 60
mg/ml, usando como control negativo dimetilsulfóxido (DMSO) y amikacina
(5 mg/ml) como control positivo. El porcentaje del efecto inhibitorio relativo
de cada extracto respecto al control positivo se calculó de acuerdo a Márquez
et al. (2005):
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
Los ensayos de caracterización cualitativa realizados al extracto en
etanol de la corteza seca de E. fusca, indican la presencia de
metabolitos secundarios tipo alcaloides, flavonoides, terpenos y quinonas, los
cuales se encuentran registrados dentro de la fitoquímica
del género Erythrina (Calle et al. 1997, Chacha et al. 2005). Estos compuestos,
exhiben interesantes actividades biológicas como antimicrobiana (Chacha et al. 2005, Sato et al. 2003,
Tanaka et al. 2002, Yenesew
et al. 2005), anti-inflamatoria (Njamen et al. 2003)
y antiplasmodial (Andayi et
al. 2006).
La citotoxicidad y la actividad de las fracciones en cloroformo y acetona
se muestran en la tabla 1. Los resultados muestran que la fracción clorofórmica
es más tóxica que la fracción en acetona. Frente a la cepa NF54 de P. falciparum
sensible a la cloroquina muestra porcentaje de
citotoxicidad de 12,95 µg/ml que le atribuye actividad moderada de acuerdo al
criterio de clasificación de Deharo et al. (2000) quienes sugieren que valores
de IC50 > 10 µg/ml son clasificados como moderadamente activo.
Tabla 1.
Citotoxicidad (células U-937) y actividad antiplasmodial de las fracciones a
partir del extracto en etanol de la corteza de E. fusca en las cepas NF54
(sensible) y FCB-2 (resistente) de
Plasmodium falciparum [los valores de CC50 (IC
95%)] están expresados en µg/ml; % IPM
= promedio del porcentaje de inhibición máximo obtenido con la concentración
más alta; IS = Índice de
selectividad el cual es la relación entre toxicidad y actividad en la cepa
resistente a la cloroquina; * =
datos de actividad y toxicidad de la cloroquina expresados en nM)
El efecto
antiplasmodial in vitro de los extractos de la corteza seca de E. fusca no ha sido establecido
anteriormente; estos resultados, enfatizan la importancia de evaluar nuevas
drogas antimaláricas a partir de un enfoque etnobotánico, basados en el uso
tradicional de las plantas medicinales. Además, contribuyen a ampliar el
conocimiento de las posibles propiedades o potencialidades terapéuticas que
podemos encontrar en nuestra flora para el tratamiento de algunas patologías
comunes debido a que son mucho más económicas y accesibles; no existen
registros que indiquen resistencia de los extractos totales de las plantas,
posiblemente debido a la acción sinérgica de los diversos constituyentes; y es
posible que la fitoterapia produzca menos efectos adversos que la quimioterapia
(Willcox y Bodeker 2000).
La actividad
antiplasmodial de algunas especies de este mismo género ha sido investigada previamente.
Yenesew et al. (2004) encontraron que el extracto en acetato de etilo de la
corteza de E. abyssinica mostró
actividad antiplasmodial in vitro con IC50 de 7,9 ± 1,1 y 5,3 ± 0,7
µg/ml en las cepas D6 (sensible a CQ) y W2 (resistente CQ) de P. falciparum, respectivamente. A partir
de este extracto, lograron aislar una nueva chalcona:
20,3,4,40-tetrahidroxi-5-prenylchalcona y una nueva flavanona:
40,7-dihidroxi-30-metoxi-50-prenylflavanona. Estos compuestos parecen ser los
responsables de la actividad antiplasmodial del extracto. Por otra parte,
Andayi et al. (2006) encontraron que los extractos en acetona de la corteza de
la raíz y del tallo de E. sacleuxii
presentaron actividad antiplasmodial en las cepas D6 (para la raíz IC50
= 1,34 ± 0,3 µg/ml y tallo IC50 = 6,3 ± 1,4 µg/ml) y W2 (IC50
= 2,2 ± 0,6 µg/ml e IC50 = 3,8 ± 0,9 µg/ml) de P. falciparum. Según los investigadores, la actividad de los
extractos es atribuida a los flavonoides e isoflavonoides, de los cuales,
lograron aislar la 7-hidroxi-4 'metoxi-3'-prenylisoflavona.
Evaluación de la actividad
antibacterial. Los resultados de la prueba de sensibilidad bacteriana revelaron que B. subtilis, P. aeruginosa y
S. aureus presentaron
inhibición de crecimiento en el extracto etanólico (EtOH) y la fracción en cloroformo (CHCl3),
siendo estos microorganismos y extractos seleccionados para el ensayo de
difusión en agar. Las tablas 2 y 3 muestran los promedios de los diámetros del
halo de inhibición y los porcentajes de inhibición relativos de las bacterias
en la prueba de difusión en agar con el extracto en etanol y fracción en cloroformo.
Tabla 2. Actividad
antimicrobiana in vitro de diferentes concentraciones del extracto en etanol de
la corteza de Erythrina fusca (Fabaceae)
[p. h. I =
promedio del diámetro del halo de inhibición en milímetros; % I
= promedio de inhibición; Amikacina+ = 5 mg/ml,
control positivo; DMSO- = dimetilsulfóxido, control negativo]
|
|
|
Extracto etanólico |
|||||||||||
|
Concentración |
|
P. aeruginosa |
|
S. aureus |
|
B. subtilis |
|||||||
|
(mg/ml) |
|
p. h. I |
|
% I |
|
p. h. I |
|
% I |
|
p. h. I |
|
% I |
|
|
DMSO- |
|
0,00 |
|
0,00 |
|
0,00 |
|
0,00 |
|
0,00 |
|
0,00 |
|
|
5 |
|
9,80 |
|
36,40 |
|
9,30 |
|
36,40 |
|
4,50 |
|
29,20 |
|
|
20 |
|
13,70 |
|
51,20 |
|
23,30 |
|
73,20 |
|
7,80 |
|
43,00 |
|
|
40 |
|
19,63 |
|
73,22 |
|
18,10 |
|
64,40 |
|
8,80 |
|
51,90 |
|
|
60 |
|
17,54 |
|
64,43 |
|
12,80 |
|
51,20 |
|
9,30 |
|
55,00 |
|
|
Amikacina+ |
|
26,81 |
|
100,00 |
|
29,40 |
|
100,00 |
|
16,90 |
|
100,00 |
|
Tabla 3. Actividad
antimicrobiana in vitro de la fracción clorofórmica preparada a partir del
extracto en etanol de la corteza de Erythrina
fusca (Fabaceae) [p. h. I =
promedio del diámetro del halo de inhibición en milímetros; % I
= promedio de inhibición; Amikacina+ = 5 mg/ml,
control positivo; DMSO- = dimetilsulfóxido, control negativo]
|
|
|
Fracción clorofórmica |
||||||||||
|
Concentración |
|
P. aeruginosa |
|
S. aureus |
|
B. subtilis |
||||||
|
(mg/ml) |
|
p. h. I |
|
% I |
|
p. h. I |
|
% I |
|
p. h. I |
|
% I |
|
DMSO- |
|
0,00 |
|
0,00 |
|
0,00 |
|
0,00 |
|
0,00 |
|
0,00 |
|
5 |
|
13,60 |
|
51,60 |
|
14,20 |
|
47,31 |
|
9,30 |
|
55,60 |
|
20 |
|
22,40 |
|
84,80 |
|
27,00 |
|
90,00 |
|
10,30 |
|
84,80 |
|
40 |
|
22,90 |
|
86,80 |
|
23,20 |
|
77,12 |
|
14,10 |
|
75,80 |
|
60 |
|
21,80 |
|
82,70 |
|
20,10 |
|
66,60 |
|
12,60 |
|
61,90 |
|
Amikacina+ |
|
26,40 |
|
100,00 |
|
30,10 |
|
100,00 |
|
16,70 |
|
100,00 |
El extracto etanólico y la fracción
clorofórmica mostraron mayores halos de inhibición en S. aureus (23,29 mm) y (27,04 mm) a la
concentración de 20 mg/ml y P. aeruginosa (19,63 mm) y (22,94 mm) a la concentración
de 40 mg/ml, respectivamente. El análisis de varianza que se aplicó a estos
resultados indica que existen diferencias altamente significativas (P ≤ 0,0001)
entre los extractos y las concentraciones evaluadas. La actividad fue positiva
en todos los tratamientos, teniendo mayor efecto inhibitorio la fracción
clorofórmica sobre las bacterias B. subtilis, P. aeruginosa
y S. aureus a
las diferentes concentraciones ensayadas. Estos resultados positivos coinciden
con los obtenidos por Calle et al. (1997), quienes encontraron que los
extractos evaluados (etanólico, cloruro de metileno,
acetato de etilo e isobutanólico), fueron activos
frente a B. subtilis, K. pneumoniae,
S. typhymurium y S. aureus.
Se conoce que la actividad antibacteriana está relacionada con los
metabolitos secundarios tipo terpenos, alcaloides y flavonoides (Prego et al. 1999); los que de acuerdo al tamizaje fitoquímico realizado al extracto de la corteza seca de E.
fusca se encuentran presentes en este.
CONCLUSIONES
La fracción clorofórmica del extracto
de la corteza seca de E. fusca es más toxica que la fracción en
acetona. Frente a la cepa NF54 muestra porcentaje de citotoxicidad de 12,95 µg/ml que le atribuye actividad moderada frente a esta
cepa de acuerdo al criterio de clasificación de
Deharo et al. (2000) quienes sugieren que un valor de IC50 > 10
µg/ml es clasificado como moderadamente activo. La fracción clorofórmica o de mediana polaridad presentó
el mayor porcentaje de inhibición relativo sobre S. aureus (90,00%) y B.
subtilis, (84,80%), a la concentración de 20 mg/ml.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo fue realizado con el apoyo
financiero de la Universidad de Sucre y Universidad de Antioquia (a través de
su programa estrategia de sostenibilidad). Los autores agradecen de forma
especial a Silvia Blair Trujillo, integrante del grupo de investigación Malaria
de la Universidad de Antioquia por la lectura crítica del documento.
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