Inocuidad citotóxica y mutagénica de los aceites
esenciales de Rosmarinus officinalis
L. y Ruta graveolens L. promisorios
para el tratamiento complementario de la infección por Helicobacter pylori
Cytotoxic and mutagenic
safety of essential oils Rosmarinus
officinalis L. and Ruta graveolens
L. complementary promising treatment of Helicobacter
pylori infection
Sandra J. Mena-Huertas1, 4, 5, Juan P.
García-López1, 6, Sindy
N. Nicola-Benavides2, 7,
María C. Yépez-Chamorro3, 8
Resumen
La
infección por Helicobacter pylori
afecta aproximadamente la mitad de la población mundial, se adquiere en la
infancia y se ha asociado con desarrollo de gastritis crónica, úlcera péptica y
cáncer de estómago en la edad adulta. El tratamiento que incluye dos o tres
antibióticos ha generado problemas de resistencia bacteriana, efectividad,
costo y seguridad; evidenciando la necesidad del desarrollo de nuevas terapias
alternativas. El grupo de investigación Salud Pública de la Universidad de
Nariño (Pasto, Colombia), determinó que los aceites esenciales puros de Rosmarinus officinalis L. y Ruta graveolens L. presentan actividad
anti-H. pylori in vitro; pero no analizaron su inocuidad para consumo humano. Este
estudio evalúa la citotoxicidad de ambos aceites en linfocitos humanos
mantenidos en cultivo y su mutagenicidad mediante el prueba de Ames con la cepa
TA-100 de Salmonella typhimurium. El aceite
esencial de R. officinalis no presentó
efecto citotóxico ni mutagénico en ninguna concentración evaluada en
comparación con los controles. El aceite esencial puro de R. graveolens fue citotóxico (viabilidad de linfocitos inferior al
40%); sin embargo, en diluciones 10-1 hasta 10-5, este
aceite se considera seguro en los dos sistemas de ensayo. Estos resultados
demuestran que ambos extractos son promisorios para el consumo humano y a
futuro, podrían considerarse como una alternativa para tratamiento
complementario de H. pylori.
Palabras clave: aceites esenciales, citotoxicidad, Helicobacter pylori, mutagenicidad, Rosmarinus officinalis, Ruta graveolens
Abstract
Helicobacter pylori infection
affects about half of world population, is acquired in infancy and has been
associated with chronic gastritis, peptic ulcer and stomach cancer development
in adulthood. Usual treatment includes two or three antibiotics and has led to
problems of bacterial resistance, effectiveness, cost and safety; showing the
need to develop alternative therapies. Public Health research group at the
University of Nariño (Pasto, Colombia), found that essential oils of Rosmarinus officinalis (L.) and Ruta
graveolens (L.) have anti-H. pylori
activity in vitro; however, did not
examine its safety for human consumption. This study evaluates the cytotoxicity
of both oils in human lymphocytes maintained in culture and its mutagenicity by
the Ames prueba with Salmonella
typhimurium strain TA-100. Essential oil
of R. officinalis did not present
cytotoxic or mutagenic effect in any concentration compared to controls. R. graveolens essential oil concentrate
was cytotoxic (cell viability 40% lower), in dilutions 10-1 to 10-5
this oil, although, is considered safe in in the two assay systems. These
results show that both extracts are promissory for human consumption and in the
future, could be considered as an alternative for adjunctive treatment of H. pylori.
Key words: essential oils, cytotoxicity, mutagenicity, Helicobacter pylori, Rosmarinus officinalis,
Ruta graveolens
INTRODUCCIÓN
A nivel mundial se ha
generado una gran preocupación asociada a la rápida propagación de clones
bacterianos resistentes a las terapias convencionales con antibióticos (Maves
et al. 2011). Esto, ha hecho necesaria la búsqueda de alternativas de
tratamiento de infecciones bacterianas, y los metabolitos
de las plantas son una opción interesante dado que, muchos de ellos tienen una
fuerte actividad antimicrobiana (Silva y Fernandes 2010). Su acción sinérgica
entre sí y en combinación con antibióticos y quimioterapéuticos hacen un
valioso complemento a la terapia anti-infecciosa (Aboaba et al. 2006, Burt 2004).
La infección por Helicobacter pylori presenta altas tasas
de incidencia a nivel mundial y causa inflamación crónica del estómago, que
aumenta el riesgo de desarrollar úlcera péptica y cáncer gástrico. Generalmente
la infección
se adquiere en la infancia y suele persistir a largo plazo sin síntomas
específicos (Goodman et al. 1997, 2011). El tratamiento de primera línea para
la erradicación de H. pylori incluye
tres fármacos: un inhibidor de la bomba de protones (PPI) y los antibióticos amoxicilina y claritromicina (CAM), pero la erradicación solo ocurre
en el 70-90% de los casos, generando así cepas resistentes, de allí la
importancia de buscar terapias alternativas que permitan realizar mejor manejo
de esta infección (Deguchi et al. 2012). Estudios previos realizados en nuestro
grupo de investigación, teniendo como base los usos etnobotánicos de algunas
plantas de la región sur occidental de Colombia, demostraron que existe elevado
potencial del aceite esencial de follaje de Ruta
graveolens L. (ruda) y Rosmarinus
officinalis L. (romero) para controlar in
vitro cepas de H. pylori,
aisladas de biopsias de pacientes (Mena y Yépez 2007).
La especie R. graveolens conocida popularmente
como ruda, es un arbusto pequeño de hoja perenne fuertemente aromática perteneciente
a la familia Rutaceae que se distribuye en todo el mundo y ha sido utilizada en
tratamientos medicinales desde la época de los griegos y romanos (Kannan y Babu
2012). Posee más de 120 compuestos, principalmente alcaloides, cumarinas,
aceites esenciales, flavonoides y las fluoroquinolonas, por ello ha sido
ampliamente utilizada en la medicina tradicional de diferentes países para el
tratamiento de trastornos que incluyen procesos infecciosos e inflamatorios,
patologías digestivas, musculares e incluso control tumoral (Preethi et al.
2006). Por otro lado, R. officinalis,
conocido como romero, es un arbusto aromático, perteneciente a la familia de
las Lamiaceae, es apreciado por su potencial terapéutico y utilizado para el
tratamiento de trastornos respiratorios o gastrointestinales, resfriados,
fiebre, tos, asma, sinusitis, reumatismo, tratamientos antimicrobianos, e
incluso en desordenes cardiovasculares, nerviosos y terapia antitumoral, así
como acelerar el proceso de cicatrización de heridas (Barnes et al. 2007, Bradley 2006, Sienkiewicz et
al. 2013).
Los resultados obtenidos en
la investigación de Mena y Yépez (2007), en relación a los aceites esenciales
de estas plantas, determinan que tienen un potencial in vitro anti-H. pylori, sin
embargo, para poder recomendarlos como una posible terapia complementaria
contra la infección, es necesario estudiar sus posibles efectos deletéreos en
diversos sistemas celulares, determinar dosis efectivas mínimas, establecer su
formulación, entre otros, antes de hacer pruebas in vivo y poder recomendarlos para el consumo humano. En este
estudio se evaluó el efecto citotóxico de los aceites esenciales de R. graveolens y R. officinalis en linfocitos humanos y su efecto mutagénico con la
prueba de mutagenicidad en Salmonella
typhimurium, usando la cepa TA-100 his- (Maron y Ames 1983).
MATERIALES Y MÉTODOS
Material biológico. La recolección de las muestras se realizó siguiendo
el modelo de muestreo aleatorio simple en 9 cultivos caseros de 3 zonas rurales
del municipio de Pasto, departamento de Nariño (Colombia), a partir de los
cuales fueron recolectadas al azar plantas o follaje en buen estado, libres de
patógenos evidentes, y posteriormente, se verificó su clasificación en el
herbario PSO de la Universidad del Nariño con la colaboración del director del
Herbario, luego fueron deshidratados mediante secado en el horno a 37 °C
durante 24 h antes de la extracción. Para obtener los extractos de aceite
esencial (AE) se utilizó el método
de hidrodestilación asistida por radiación con microondas (MWHD) según el protocolo estandarizado por Gómez y Moran (2005). Brevemente,
se trituró 1.500 g de material seco y se introdujo en un balón de 4 l de
capacidad, al que se adicionaron 200 ml de agua destilada y se acopló al
sistema de hidrodestilación tipo Clevenger, con reservorio de destilación tipo
Dean-Stark y calentamiento por radiación mediante un horno microondas (modelo LG
MB-14VG), con una potencia de salida 2.450 MHz (7% de la potencia máxima)
durante 90 min, con 1 min intermedio de pausa cada 10 min. El aceite esencial fue
recolectado en tubos tipo Ependorff ámbar de 1,5 ml estériles, alicuotados en
100 µl, cubiertos con papel aluminio y conservados a -20 °C hasta su posterior evaluación.
Análisis de citotoxicidad y determinación de
concentraciones de trabajo.
Para esta prueba se emplearon linfocitos humanos de sangre periférica de un
donante, que ha criterio clínico y mediante interrogatorio medico cumplió con
los siguientes requisitos: ser joven (20 a 35 años), no fumador, no haber
ingerido alcohol un mes antes de la donación de sangre, quien firmó el
respectivo consentimiento para participar en este estudio. Los linfocitos se
aislaron por el método tradicional en gradiente de Hystopaque® (Boyum
1968). Para esto, se recolectaron 5 ml de sangre en un tubo Vacutainer con
heparina y se mezcló por inversión con 5 ml de buffer fosfato de sodio (PBS)
en proporción 1:1, posteriormente, 5 ml de esta mezcla se transfirieron,
lentamente por las paredes y evitando la formación de turbulencia, a un tubo
Falcon de 15 ml de capacidad que contenía 3 ml de Hystopaque®1077 de
Sigma (Boyum 1968), se verificó la formación de dos capas y se centrifugó
durante 30 min a 2.000 rpm, se extrajo con precaución la capa de linfocitos y
se transfirió a otro tubo limpio y seco. Finalmente, se descartó el PBS y se
agregó 1 ml de medio RPMI-1640 (sigma) suplementado con suero fetal bovino (SFB) al 10%. Se determinó la
viabilidad inicial mediante la técnica de exclusión por azul de tripano y se
incubaron en el mismo medio a 37 ºC por 6 h.
Posteriormente, se evaluaron
4 concentraciones de aceite esencial, desde puro hasta 10-3, las diluciones
seriadas se hicieron en DMSO al 1%. La prueba se realizó en una solución de
100.000 linfocitos y 10 µl de la solución del extracto a evaluar en cada una de
las concentraciones, además del control respectivo con DMSO al 1%, se
cultivaron en medio RPMI suplementado con SFB al 10% en un volumen final de 250
µl. Se incubaron a 37 °C y cada hora se evaluó la viabilidad mediante el método
de exclusión de azul de tripano, durante 6 h.
En cada caso se realizaron
tres experimentos independientes (n = 3), cada uno por duplicado. Se calculó el
porcentaje de viabilidad absoluta y los resultados se analizaron mediante una
prueba de t múltiple y la significancia se determinó con el método Holm-Sidak
en el software Pad Prism v5.0
(GraphPad Software Inc. CA, EE. UU.). Los aceites se consideraron citotóxicos
si el porcentaje de viabilidad calculado estaba en un rango entre el 0 a 39%, moderadamente
citotóxicos si la viabilidad oscilaba entre 40 a 79% y no citotóxicos cuando
presentaban un porcentaje de viabilidad igual o superior al 80% (Mena et al.
2011).
Ensayo de mutagenecidad y premutagenicidad. Para este ensayo se utilizó la cepa TA-100 his-, donada
por el Laboratorio de Mutagénesis de la Universidad de Antioquia y diseñada por
Bruce Ames, que detecta un amplio rango de sustancias químicas que pueden
producir daño genético, específicamente esta cepa detecta mutaciones por
sustitución de pares de bases (Maron y Ames 1983). Se verificó que los
controles de reversión espontánea de la cepa TA-100 estuviesen dentro del rango
establecido a nivel mundial (Mortelmans y Zeiger 2000) y se siguió el protocolo
descrito por Maron y Ames (1983). La ejecución del ensayo consistió en el
análisis de las dosis de los dos tipos de aceites, previamente determinadas con
el análisis de citotoxicidad, incluyendo las diluciones 10-4 y 10-5,
con la cepa TA-100 sin y con activación metabólica (en presencia
de la fracción microsomal S9). Se realizó una mezcla de 100 ml de inóculo de la cepa TA-100 (1 x 108 bacterias
aproximadamente) con 100 ml de la dilución de AE a evaluar y se incubó durante
30 min a 37 °C, posteriormente se mezcló con el top agar, esta mezcla se sirvió en agar mínimo, se llevó a
incubación a 37 °C durante 48 h. Al finalizar este tiempo, se hizo el recuento
de colonias revertantes y se creó una base de datos con estos resultados para
su posterior análisis. Se realizaron tres experimentos independientes, cada uno
por duplicado y se incluyeron como controles positivos: 2 aminofluoreno (2AF) (10 mg por placa) en el tratamiento con S9 y azida de
sodio (NaN3) (5 mg por placa) en el tratamiento sin S9, el control
negativo fue DMSO al 1%.
Para cuantificar la
mutagenicidad se utilizó el índice de mutagenicidad (Ím), obtenido de los promedios de tres experimentos
independientes, cada uno por duplicado. El Ím se refiere al número de veces que
el tratamiento supera la mutagenicidad del control. Teniendo en cuenta los
criterios de Watanabe et al. (2003), se establecieron las siguientes
categorías:
NM = no mutagénico Þ índice de mutagenicidad menor de 1,5
LM = ligeramente mutagénico Þ índice de mutagenicidad entre 1,5-1,9
MM = medianamente mutagénico Þ índice de mutagenicidad entre 2,0-2,9
AM = altamente mutagénico Þ índice de mutagenicidad mayor o igual a 3
Los análisis de los resultados
del número de colonias revertantes de las diferentes pruebas se realizaron
usando el software Pad Prism v5.0 de
(GraphPad Software Inc. CA, EE. UU.), se realizó análisis de varianza con un α =
0,05 y un valor de confiabilidad del 99%, y posterior análisis de medias tipo Dunnett.
RESULTADOS
Ensayo de citotoxicidad. El análisis de varianza realizado con el porcentaje
de viabilidad de los linfocitos humanos del ensayo de citotoxicidad, señala que
para el caso de aceite esencial de R.
graveolens existen diferencias estadísticas significativas entre los
conteos celulares obtenidos con en el tratamiento con extracto puro y el resto
de tratamientos (p < 0,05), demostrando que el extracto puro presenta
citotoxicidad con una viabilidad inferior al 40% en 6 h de cultivo (figura 1),
por esta razón el extracto puro se descartó para el posterior análisis de
mutagenicidad. En el caso de aceite esencial de R. officinalis, no se observaron diferencias estadísticas
significativas entre las concentraciones estudiadas y el control (figura 2), por
lo tanto se consideraron todas las concentraciones (v/v) para los análisis de
premutagenicidad y mutagenicidad.
Figura
1.
Porcentaje de viabilidad observada en linfocitos humanos al ser tratados con
diferentes concentraciones de aceite escencial de Ruta graveolens L. (resultados se analizaron mediante prueba de t
múltiple, significancia determinada con el método Holm-Sidak; * = p < 0,05)
Figura 2.
Porcentaje de viabilidad observada en linfocitos humanos al ser tratados con
diferentes concentraciones de aceite escencial de de Rosmarinus officinalis L. (resultados se analizaron mediante prueba
de t múltiple, significancia determinada con el método Holm-Sidak; * = p <
0,05)
Con los resultados obtenidos
se determinó que el AE puro de R.
graveolens induce citotoxicidad, el resto de diluciones evaluadas (10-1
a 10-3), se consideran no citotóxicas para este sistema de ensayo.
Para el caso de R. officinalis, el AE
puro y las diluciones evaluadas (10-1 a 10-3) no son
citotóxicas. Sin embargo, para ambos tipos de aceites es necesario realizar
pruebas adicionales en otros sistemas de ensayo para descartar cualquier tipo
de daño celular que puedan causar.
Ensayo de mutagenecidad en Salmonella typhimurium (prueba de Ames). Las pruebas para requerimiento de histidina,
mutación rfa, mutación uvrB, y la presencia del factor R del plásmido
PKM101 de resistencia a ampicilina de
la cepa TA-100 fueron positivas (Maron y Ames, 1983), los valores de reversión
espontánea observados se encontraron dentro del rango estandarizado en el laboratorio
de Mutagénesis de la Universidad de Antioquia, Medellín (entre 75-90 colonias).
Al evaluar el promedio de colonias revertantes observadas en cada caja,
solamente los controles positivos en cada uno de los ensayos presentan
diferencias estadísticas significativas respecto al control negativo con
solvente tanto para el aceite esencial de R.
graveolens (figura 3) como para el de R.
officinalis (figura 4). Evidenciando así ausencia de efecto mutagénico ó
premutagénico en ambos extractos y en las concentraciones evaluadas.
Figura 3.
Resultados de la prueba de Ames realizada con aceite esencial de Ruta graveolens L. Barras negras: promedio
de colonias revertantes observadas en ensayo de mutagenicidad sin activación
metabólica [control positivo usado = azida de sodio (NaN3)]. Barras blancas: promedio de colonias
revertantes observadas en ensayo de mutagenicidad con activación metabólica con
S9 (premutagenicidad) [control
positivo usado = 2aminofluoreno (2AF);
ensayos realizados por duplicado; n
= 3; análisis de varianza con un α = 0,05 y posterior análisis de medias tipo
Dunnett; *** = p < 0,001; S =
solvente DMSO 1%, C+ = control
positivo, S9 = fracción microsomal]
Figura 4. Resultados de la
prueba de Ames realizada con aceite esencial de Rosmarinus officinalis L.
Barras
negras: promedio de colonias revertantes observadas en ensayo de
mutagenicidad sin activación metabólica [control positivo usado = azida de
sodio (NaN3)]. Barras blancas:
promedio de colonias revertantes observadas en ensayo de mutagenicidad con
activación metabólica con S9
(premutagenicidad) [control positivo usado = 2aminofluoreno (2AF); ensayos realizados por
duplicado; n = 3; análisis de
varianza con un α = 0,05 y posterior análisis de medias tipo Dunnett; *** = p
< 0,001; S = solvente DMSO 1%, C+ = control positivo, S9 = fracción microsomal]
Índice de mutación (Ím). En la tabla 1, se muestran los valores
correspondientes al Ím obtenidos para el aceite esencial de R. graveolens y de R. officinalis respectivamente. Estos resultados sugieren que no
hubo actividad mutagénica con la cepa TA-100 de S. typhimurium en ninguna de las concentraciones evaluadas, en los
dos tipos de aceite esencial el Ím fue menor de 1,5.
Tabla 1.
Índices de mutagenicidad obtenidos con aceites esenciales de Ruta graveolens L. (Ae Rg) y Rosmarinus officinalis L. (Ae Ro)
para ensayos sin activación
(mutagenicidad) y con activación
metabólica (premutagenicidad) (S9 = fracción microsomal para
inducir activación metabólica; Ím = Índice de mutación; Cual
= Cualidad; DMSO = Dimetil
Sulfóxido NaN3 = azida de sodio; 2AF = 2 aminofluoreno; NE
= no evaluado; NM= no mutagénico; AM = altamente mutagénico)
DISCUSIÓN
La infección por H.
pylori afecta a aproximadamente la
mitad de la población mundial, generalmente se adquiere
en la infancia y se ha asociada con el desarrollo de
gastritis crónica, úlcera péptica y cáncer de
estómago en la edad adulta. El tratamiento
convencional con dos o tres antibióticos más un inhibidor de la bomba de
protones, ha generado problemas asociados con la resistencia
desarrollada por las bacterias, la seguridad,
efectividad y el costo, evidenciando la necesidad de la
búsqueda de nuevas alternativas de tratamiento para la infección (Silva y
Fernandes 2010, Ryuzo et al. 2012). Una revisión hecha por Wang (2014),
relaciona 34 estudios que incluyeron a más de 80 extractos de plantas con
actividad anti-H. pylori. Mena y
Yépez (2007), evaluaron la actividad antimicrobiana in vitro de extractos de plantas medicinales promisorias sobre
aislamientos de H. pylori,
encontrando que, entre otros, los aceites esenciales puros de R. officinalis y R. graveolens presentaron actividad anti-H. pylori con halos de inhibición de 10,55 y 10,30 mm,
respectivamente. Continuando con esta línea de trabajo, en este estudio evaluamos
la actividad citotóxica y mutagénica como parte del proceso de determinar la
inocuidad y seguridad biológica de estos extractos, para poder recomendarlos a
futuro como parte de una terapia complementaria para el tratamiento de H. pylori.
Citotoxicidad. Con los resultados obtenidos en la prueba de
linfocitos se determinó que el aceite esencial puro de R. graveolens presenta diferencias estadísticas significativas en
la viabilidad celular con el control y el resto de tratamientos; esto sugiere la
presencia de citotoxicidad dado que a las 6 h de tratamiento se alcanza una
viabilidad promedio de 21%. Sin embargo, el resto de diluciones evaluadas (10-1,
10-2 y 10-3), se consideran seguras según este
estudio. En relación a este fenómeno, se puede señalar que de manera general
ensayos fisicoquímicos in vitro han
caracterizado a la mayoría de los aceites esenciales de plantas aromáticas como
antioxidantes; pero, algunos estudios demuestran que en las células eucariotas
los aceites esenciales de plantas aromáticas pueden actuar como prooxidantes y,
que según el tipo y la concentración, estos pueden exhibir efectos citotóxicos
en las células (Bakkali et al. 2008). Aunque se desconocen los mecanismos
específicos de citotoxicidad asociados a los aceites esenciales, estos bien
pudieran involucrar cambios en la permeabilidad de las membranas o en la
actividad de enzimas mitocondriales que conducirían a la muerte celular (Bakkali
et al. 2008, Di Pascua et al. 2007). El estudio de Varamini et al. (2009)
usando ensayo de proliferación celular WST-1, demuestra actividad citotóxica del
extracto total puro de R. graveolens
sobre líneas celulares tumorales de diferente origen, en cada una de las líneas
evaluadas presentaron distintos niveles de toxicidad, destacándose la actividad
observada sobre las líneas RAJI y RAMOS. Trovato et al. (1996), señalan que
probablemente la citotoxicidad está asociada a la presencia de flavonoides en
los extractos de dicha planta. Si este aceite esencial estuviese generando
cambios en la permeabilidad de membrana que pueden afectar la viabilidad
celular como lo señalaron Bakkali et al. (2008), de alguna manera, la actividad
citotóxica observada en el ensayo, podría estar asociada al efecto bactericida determinado
en el trabajo de Mena y Yépez (2007) sobre aislamientos de H. pylori.
Coincidiendo con los resultados de este estudio, no se
encontró antecedentes bibliográficos de citotoxicidad por extractos de R. officinalis. Estudios realizados por Bai
et al. (2010), aseguran que compuestos flavonoides aislados de esta especie han
presentado efecto antioxidante y anti-inflamatorio desde leve a intenso sobre
diversas líneas celulares. Kim et al. (2010), señalan que el diterpeno fenólico
“carnosol” presente en R. officinalis
tiene efecto protector sobre la línea celular glial c6 cuando ha sido sometida
a toxicidad inducida. Al revisar estudios relacionados con la actividad
biológica del aceite esencial de R. officinalis
se encontró que Vijayan et al. (2004), demostraron que el AE puro de esta
planta presentó una actividad antiviral moderada sobre HSV-1 (Herpes simplex).
Ensayo de mutagenicidad (prueba
de Ames). Se
demostró que las dosis evaluadas para cada uno de los extractos de R. graveolens y R. officinalis no indujeron efecto mutagénico ni premutagénico en
el ensayo de mutagenecidad con preincubación y activación metabólica en S. typhimurium en la cepa TA-100.
Varios estudios con diferentes aceites esenciales o
sus componentes principales han demostrado que, de manera general no inducen
mutaciones nucleares. Según Bakkali et al. (2008), la mayor parte de los
aceites esenciales se han caracterizado por no presentar efectos mutagénicos y
es probable que también estén desprovistos de carcinogenicidad. En la década de
los 90 se realizaron varias investigaciones con compuestos aislados de R. graveolens, por ejemplo; el alcaloide
puro isogravacridonchlorina aislado de la raíz de la planta fue evaluado por
Paulini et al. (1991) y determinaron que actuaba como potente causante de
mutaciones frameshift en S. typhimurium.
Por otro lado, Schimmer et al. (1991) señalaron el efecto de furocoumarinas
(compuestos presentes en el aceite esencial del follaje de R. graveolens) como inhibitorio del efecto premutagénico de
dictamnina y rutacridona también aislados de R. graveolens, concluyendo que el efecto inhibitorio probablemente
ocurre por la inactivación que produce la furocoumarina del complejo enzimático
P450 que está encargado de la activación de premutágenos, en el caso de la
reducción de premutagenicidad de dictamnina puede deberse a un sistema
competitivo con la furocumarina por el mismo sitio de unión a la molécula de
ADN. Por lo tanto, es probable que los compuestos presentes en el aceite
esencial de ruda realicen sistemas de autorregulación entre sí que controlen el
efecto mutagénico y premutágenico de estos extractos, explicando así los
resultados obtenidos en esta investigación.
Recientemente, un estudio realizado en la línea
celular en células HepG2 por Zegura et al. (2011), con el extracto comercial
AquaROX®15 de R. officinalis,
demuestra un claro efecto protector de este extracto ante mutaciones inducidas
por 4-nitroquinolina-N-oxido (NQNO)
y 2-amino-3-metil-3H-imidazol[4,5-F]quinolina (IQ) en S. typhimurium TA-98,
considerándolo así como un producto potencialmente antimutágeno y antioxidante.
Esto coincide ampliamente con los resultados de nuestro estudio en el que
ninguna de las dosis de AE de esta planta, produjo efecto mutagénico, sería
interesante evaluar a futuro su efecto anti-mutagénico.
Los constituyentes más importantes de los extractos
de romero son: el ácido rosmarínico, ácido carnósico, carnosol, rosmanol,
flavonoides y otros compuestos fenólicos (Hernández et al. 2009). El ácido
rosmarínico es un éster de ácido cafeico y ácido 3,4-dihydroxifenilictico del cual
se ha demostrado un amplio número de actividades biológicas interesantes tales
como anti-depresivo, hepato-protectora, anti-inflamatoria, anti-angiogénico,
antitumoral y agente fotoprotector, entre otras (Li et al. 2010, Peng et al.
2007). El ácido carnósico y carnosol, poseen propiedades anti-bacterianas,
anti-mutagénicas, anti-inflamatorias antiproliferativas, anti-tumorigénicas y
neuroprotectoras (Izumi et al. 2007, Oluwatuyi et al. 2004, Peng et al. 2007, Satoh et al. 2008). El ácido
carnósico y el carnosol se considera que representan más del 90% de las
propiedades antioxidantes del extracto de romero, son potentes inhibidores de
la peroxidación de lípidos y buenos eliminadores de radicales peroxilo (Aruoma
et al. 1992). Se ha demostrado que carnosol interfiere con la metástasis de
células tumorales, la quimiotaxis, la unión y la inhibición de la invasión por
la orientación eventos celulares mediados por mataloproteinasas (Huang y Zheng
2006). Estos componentes interactuando en la mezcla compleja del aceite
esencial utilizado en este estudio explican claramente los resultados obtenidos
y permiten considerarlo como un extracto potencial para el consumo humano.
Los resultados de mutagenicidad y citotoxicidad de
los aceites esenciales de R. graveolens
y R. officinalis son similares a los
obtenidos con el aceite esencial de Carica
candamarcensis que también ha demostrado ser promisorio para el control in vitro de H. pylori (Mena et al. 2011).
En conclusión, el aceite esencial puro de R. graveolens se considera citotóxico;
por ello, en esta concentración no se puede recomendar para consumo humano; sin
embargo, el resto de concentraciones evaluadas se consideran “seguras” de
acuerdo a los sistemas de ensayo utilizados. En el caso del aceite esencial de R. officinalis, no se observaron
indicios de actividad citotóxica y mutagénica a ninguna concentración, por lo
tanto los dos tipos de extractos podrían ser potencialmente usados en una
terapia complementaria anti-H. pylori.
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos la financiación de este trabajo al
sistema de investigaciones de la Universidad de Nariño y al Centro de Estudios
en Salud de la Universidad de Nariño. Al laboratorio de Mutagénesis de la
Universidad de Antioquia por la donación de la cepa TA-100 de S. typhimurium usada en este estudio. A
Jhon Jairo Calderón por sus aportes en el componente estadístico.
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