Daño nuclear en neuronas de cerebros de pacientes con enfermedad de Alzheimer y otras demencias - García, Gloria Patricia; Jiménez, Marlene; Vélez, Carlos; Lopera, Francisco (Iatreia, 2000)
Introducción: La enfermedad de Alzheimer (EA) es una entidad neurodegenerativa y es la causa más común de demencia. Recientemente se reportó en Antioquia (Colombia) un grupo familiar con una mutación puntual en el codon 280 de la Presenilina 1 denominada E280A (sustitución de un ácido glutámico por una alanina), la cual produce un incremento en el acúmulo de b-Amiloide (bA) de 42-43 aminoácidos y una patología cerebral severa. Durante los últimos años se ha propuesto que la muerte celular es uno de los factores principales de pérdida neuronal en la EA. Hasta el presente no se ha establecido el tipo de muerte celular implicadas en la pérdida neuronal. Por lo tanto el objetivo de esta investigación es establecer el tipo de muerte celular que ocurre en la EA y otras demencias tales como la Demencia Fronto Temporal (DFT), Huntington y Demencia Cerebro Vascular, con base en los siguientes criterios: 1. Fragmentación del ADN. 2. Cambios morfológicos nucleares. 3. Cambios citoplasmáticos y 4. Expresión de ciertas proteínas asociadas a muerte celular. Los resultados de esta investigación permitirán establecer una correlación entre los parámetros morfológicos e histoquímicos antes mencionados, entre placas de bA y ovillos neurofibrilares en la EA y con ovillos neurofibrilares en la DFT adicionalmente. Este trabajo nos permitirá determinar si existe un mecanismo común de muerte celular en las enfermedades neurodegenerativas con demencia. Objetivo General: Contribuir a la caracterización de los procesos de muerte celular en cerebros de pacientes con enfermedades neurodegenerativas Objetivos específicos: - Estandarizar un estudio cualitativo in situ para evaluar procesos de muerte celular neuronal en micro-secciones histológicas de las regiones cerebrales frontal, temporal, parietal, hipocampo, occipital y cerebelo de pacientes con la enfermedad de Alzheimer y otras demencias. - Establecer una correlación patológica entre la proporción de núcleos fragmentados y la presencia de placas seniles bA y ovillos neurofibrilares. - Establecer la correlación entre la expresión de las proteínas asociadas a muerte celular como Bax, p53, NF-kB, Par 4 y la fragmentación del ADN. Materiales y Métodos Preparaciones Histológicas: Secciones de tejido de cerebros humanos post-mortem de las regiones seleccionadas provenientes de pacientes con demencia, serán fijadas en formaldehido buferizado y embebidos en bloques de parafina. Secciones de 5mm serán adheridos a láminas precargadas. La deparafinización e hidratación se realizará de acuerdo a procedimientos estandares de histología (Gavrieli et al.,1992). Técnica de marcaje Tunel y Thioflavina: Las secciones serán marcadas in situ para TUNEL (terminal transferasemediated dUTP-fluorecent nick labeling tecnique) de acuerdo al método descrito por Gavrieli et al., 1992 y al protocolo Promega de 1998. Adicionalmente, las láminas serán marcadas con Thioflavina-S para evidenciar las placas seniles bA y ovillos neurofibrilares (Smale et al., 1995). La evaluación semicuantitativa tanto de núcleos Tunel+, como de placas seniles y ovillos se realizarán de acuerdo a Mirra et al. 1991 y Troncoso et al. 1996 respectivamente. Inmunohistoquímica: Las microsecciones del cerebro, se incubarán con los anticuerpos primarios anti-p53, anti-p65(NF-kB), anti-Bax, anti-Par-4. Luego serán incubadas con anticuerpos secundarios anticonejo IgG conjugados con biotina, e incubadas con el sustrato extravidina peroxidasa. La cuantificación se realizará semi cuantitativamente de acuerdo a:(-) no coloración,(+) coloración débil, (++) coloración moderada, (+++) coloración intensa. Adicionalmente, un registro microfotográfico se realizará y los datos se tabularán en tablas.