Survival of vitrified mouse blastocysts loaded into glass micro-capillaries

  • Paula Rodriguez Villamil
  • Felipe Ongaratto
  • Daniela Scherer
  • Berenice de Ávila Rodrigues
  • José L. Rodrigues

Abstract

The purpose of this study was to determine the in vitro expansion and hatching rates of vitrified mouse blastocysts loaded into glass micro-capillaries (Brand® - 5 μL). Early morning on day 4 of pregnancy, blastocysts were collected from donors, morphologically evaluated, and then allocated in three groups: Group 1 (Control): embryos were transferred into 100 μL of KSOM medium drops and in vitro cultured during 72 h; Groups 2 and 3: embryos initially exposed to the equilibration solution (PBSm + 10% EG + 10% PROH and 0.5% PVA) for 1 min, and then to vitrification solution (PBSm + 20% EG + 20% PROH + 0.5% PVA) for 30 sec. After that, blastocysts were loaded into glass micropipettes (GMP) or glass microcapillaries (GMC) and plunged into super-cooled liquid nitrogen (-200 °C). Embryo warming and cryoprotectant dilution were carried out into 500 μL droplets of PBSm supplemented with 0.25 M sucrose maintained at 37 °C. After 5 min embryos were transferred to 100 mL droplets of KSOM medium and cultured in vitro for 72 h. Blastocyst expansion rates after in vitro culture were 77% (138/177) and 74% (131/175), for blastocysts vitrified in GMP and GMC, respectively. Blastocyst hatching rate (control group) was 91% (134/146), which was higher than for embryos loaded in GMP 61% (108/177) and GMC 53% (93/175). ICM number in control group embryos contained 25.7 ± 2.5 cells and did not differ from the mean cell number observed in vitrified embryos loaded in GMP (24.2±2.3) or GMC (22.5±2.59). Regarding the trophoectoderm cell number, Group 1 embryos displayed 63.1±3.0 cells, and also not differ from the cell numbers of the embryos loaded into GMP (58.0±1.8) or GMC (58.0±.3.7). In conclusion, manufactured GMC (Brand®) tested in this study showed same efficiency as GMP for vitrification of mouse blastocysts.Key words: blastocyst, glass micropipettes, micro capillaries, Mouse, vitrification.--------------------------------------------------------------------------------Sobrevivencia embrionaria de blastocistos murinos vitrificados en microcapilares de vidrioResumenEl objetivo de este estudio fue determinar las tazas de expansión y eclosión in vitro de los blastocistos murinos vitrificados en micro-capilares de vidrio (Brand® - 5 μL). En el día 4 de preñez, los blastocistos eran colectados de las donantes, evaluados morfológicamente y localizados en tres diferentes grupos: Grupo 1 (Control): compuesto por los embriones que eran transferidos a gotas de 100 μL de medio KSOM y cultivados in vitro por un periodo de 72 h; Grupos 2 y 3: compuesto por los embriones que eran expuestos inicialmente a la solución de equilibrio (PBSm + 10% EG + 10% PROH and 0.5% PVA) por 1 min, y posteriormente a la solución de vitrificación (PBSm + 20% EG + 20% PROH + 0.5% PVA) por un periodo de 30 seg. Posteriormente, los blastocistos, eran almacenados dentro de micro-pipetas de vidrio (GMP) o micro-capilares de vidrio (GMC) y sumergidos en nitrógeno líquido (-200 °C). La dilución de los crioprotectores y desvitrificación de los embriones fue realizada al colocarlos en gotas de 500 μL de PBSm suplementado con 0.25 M de sacarosa a una temperatura de 37 °C. Después de 5 minutos los embriones fueron transferidos a gotas de 100 μL de medio KSOM y cultivados in vitro por 72 h. Las tazas de expansión de los blastocistos, posteriores al cultivo fueron de 77% (138/177) y 74% (131/175), para los blastocistos vitrificados en GMP y GMC, respectivamente. Las tazas de eclosión fueron de 91% (134/146) para el grupo control, siendo mayores que para los embriones vitrificados en GMP 61% (108/177) y GMC 53% (93/175). El número del índice de masa celular interna (ICM) para los embriones del grupo control fue de 25.7 ± 2.5 células, no teniendo diferencia significativa con el número de células observado en los embriones vitrificados en GMP (24.2±2.3) ó GMC (22.5±2.59). Además, las células del trofoectodermo, en el grupo control presentaron 63.1±3.0 células, no siendo tampoco diferentes de las células de los embriones vitrificados en GMP (58.0±1.8) ó GMC (58.0±.3.7). En conclusión, las GMC comerciales (Brand®) probadas en este estudio muestran la misma eficiencia que las GMP para la vitrificación de embriones murinos.Palabras clave: blastocisto, micro-capilar, micro-pipeta de vidrio, murino, vitrificación.--------------------------------------------------------------------------------Sobrevivência embrionária de blastocistos murinos vitrificados em micro capilares de vidroResumoO objectivo de este estudo foi determinar as taxas de expansão e eclosão in vitro dos blastocitos murinos vitrificados em micro capilares de vidro (Brand® - 5 μL). No quarto dia de prenhes, os blastocitos foram colectados das doadoras, avaliados morfologicamente e localizados em três diferentes grupos: Grupo 1 (Controle): composto por os embriões que foram transferidos a gotas de 100 μL de KSOM e cultivados in vitro por um período de 72 h; Grupos 2 e 3: composto por os embriões que foram expostos inicialmente á solução de equilíbrio (PBSm + 10% EG + 10% PROH e 0.5% PVA) por 1 min, e posteriormente á solução de vitrificação (PBSm + 20% EG + 20% PROH + 0.5% PVA) por um período de 30 seg. Posteriormente, os blastocistos, foram armazenados dentro de micro pipetas de vidro (GMP) ou micro capilares de vidro (GMC) e submergidos em nitrogénio líquido super-resfriado (-200°C). A diluição dos crioprotetores e desvitrificação dos embriões foi realizada ao colocar-lhos em gotas de 500 μL de PBSm suplementado com 0.25 M de sacarose a uma temperatura de 37 °C. Depois de 5 minutos, os embriões foram transferidos a gotas de 100 μL de KSOM e cultivados in vitro por 72 h. As taxas de expansão dos blastocistos, posteriores ao cultivo foram de 77% (138/177) e 74% (131/175), para os blastocistos vitrificados em GMP e GMC, respectivamente. As taxas de eclosão foram de 91% (134/146) para o grupo controle, e foram maiores os embriões vitrificados em GMP 61% (108/177) e GMC 53% (93/175). O número do índice de massa celular interna (ICM) para os embriões do grupo controle foi de 25.7 ± 2.5 células, não havendo diferencia significativa com o número de células observado em embriões vitrificados em GMP (24.2±2.3) ou GMC (22.5±2.59). Alem do mais, as células do trofoectodermo, no grupo controle apresentaram 63.1±3.0 células, no sendo diferente às células dos embriões vitrificados em GMP (58.0±1.8) ou GMC (58.0±.3.7). Em conclusão, as GMC comerciais (Brand®) provadas neste estudo indicam a mesma eficiência que as GMP para a vitrificação de embriões murinos.Palavras chave: blastocisto, micro capilar, micro pipeta, murino, vitrificação.

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Paula Rodriguez Villamil
Laboratorio de embriologia e biotecnicas da reprodução-UFRGS
Published
2010-03-29
Section
Original research articles