Proteína morfogenética de hueso 2: expresión heteróloga y potencial en la regeneración ósea
DOI:
https://doi.org/10.17533/udea.acbi.v43n114a01Palabras clave:
Células C2C12, Fosfatasa alcalina, Renaturalización, hBMP‐2Resumen
Actualmente la proteína morfogénica ósea 2 (BMP-2) es uno de los dos factores de crecimiento más osteoinductivos usado clínicamente en dispositivos médicos que promueve la formación de hueso. Normalmente esta proteína es comprada a altos precios y en cantidades pequeñas que no alcanzan a cubrir las necesidades clínicas. Debido a esto, se ha propuesto que centros de investigación utilicen sus propios sistemas heterólogos para obtener un suministro constante. El objetivo de este trabajo es estandarizar la expresión heteróloga de la BMP-2 y evaluar su actividad osteoinductiva in vitro. Nuestro procedimiento para la expresión y purificación se basó en la tecnología de DNA recombinante usando el plásmido pET-28 e IPTG como inductor. Después de extraer la proteína de los cuerpos de inclusión, renaturalizarla y modificarla usando un sistema redox, se observó mediante electroforesis un dímero de 26 kDa. Se evaluó su actividad osteoinductiva en células mioblásticas C2C12 cuantificando enzimáticamente la actividad de la fosfatasa alcalina (ALP) y realizando una tinción de los nódulos de mineralización. La actividad de la fosfatasa alcalina fue proporcional a la concentración de BMP-2, obteniendo un aumento del 90% a concentraciones de 3 µg/mL. Estas células formaron nódulos de calcio, mineralizando un 50% la superficie.
Descargas
Citas
Allendorph, G.P., Vale, W.W., & Choe, S. (2006). Structure of the ternary signaling complex of a TGF-β superfamily member. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 103(20), 7643-7648. DOI:10.1073/pnas.0602558103
Bahney, C.S., Zondervan, R.L., Allison, P., Theologis, A., Ashley, J.W., Ahn, J., Miclau, T., Marcucio, R.S., & Hankenson, K.D. (2019). Cellular biology of fracture healing. Journal of Orthopaedic Research, 37(1), 35–50. DOI:10.1002/jor.24170
Basak, S., Paul Nobrega, R., Tavella, D., Deveau, L. M., Koga, N., Tatsumi-Koga, R., Baker, D., Massi, F., & Robert Matthews, C. (2019). Networks of electrostatic and hydrophobic interactions modulate the complex folding free energy surface of a designed βα protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 116(14), 6806–6811. DOI:10.1073/pnas.1818744116
DeLano, W.L. (2002). PyMOL: An open-source molecular graphics tool. CCP4 Newsletter On Protein Crystallography, 40, 82–92. http://148.79.162.84/newsletters/newsletter40/11_pymol.pdf
Durham, E.L., Howie, R.N., Hall, S., Larson, N., Oakes, B., Houck, R., Grey, Z., Steed, M., Larue, A.C., Muise-Helmericks, R., & Cray, J. (2018). Optimizing bone wound healing using BMP2 with absorbable collagen sponge and Talymed nanofiber scaffold 11 Medical and Health Sciences 1103 Clinical Sciences 09 Engineering 0903 Biomedical Engineering. Journal of Translational Medicine, 16(1), 1–8. DOI:10.1186/s12967-018-1697-y
Englander, S.W., & Mayne, L. (2014). The nature of protein folding pathways. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 111(45), 15873–15880. DOI:10.1073/pnas.1411798111
Fung, S.L., Wu, X., Maceren, J.P., Mao, Y., & Kohn, J. (2019). In vitro evaluation of recombinant bone morphogenetic protein-2 bioactivity for regenerative medicine. Tissue Engineering - Part C: Methods, 25(9), 553–559. DOI:10.1089/ten.tec.2019.0156
Hettiaratchi, M.H., Krishnan, L., Rouse, T., Chou, C., McDevitt, T.C., & Guldberg, R.E. (2020). Heparin-mediated delivery of bone morphogenetic protein-2 improves spatial localization of bone regeneration. Science Advances, 6(1), 1–12. DOI:10.1126/sciadv.aay1240
Ihm, H.J., Yang, S.-J., Huh, J.-W., Choi, S.Y., & Cho, S.-W. (2008). Soluble expression and purification of synthetic human bone morphogenetic protein-2 in Escherichia coli. BMB Reports, 41(5), 404–407. DOI:10.5483/BMBRep.2008.41.5.404
Kashiwagi, K., Tsuji, T., & Shiba, K. (2009). Directional BMP-2 for functionalization of titanium surfaces. Biomaterials, 30(6), 1166–1175. DOI:10.1016/j.biomaterials.2008.10.040
Kim, H.S., Neugebauer, J., McKnite, A., Tilak, A., & Christian, J.L. (2019). BMP7 functions predominantly as a heterodimer with BMP2 or BMP4 during mammalian embryogenesis. ELife, 8, 1–22. DOI:10.7554/eLife.48872
Krauss, I.R., Merlino, A., Vergara, A., & Sica, F. (2013). An overview of biological macromolecule crystallization. International Journal of Molecular Sciences, 14(6), 11643–11691. DOI:10.3390/ijms140611643
Krishnakumar, G.S., Roffi, A., Reale, D., Kon, E., & Filardo, G. (2017). Clinical application of bone morphogenetic proteins for bone healing: a systematic review. International Orthopedics, 41, 1073–1083. DOI:10.1007/s00264-017-3471-9
Long, S., Truong, L., Bennett, K., Phillips, A., Wong-Staal, F., & Ma, H. (2006). Expression, purification, and renaturation of bone morphogenetic protein-2 from Escherichia coli. Protein Expression and Purification, 46(2), 374-378. DOI:10.1016/j.pep.2005.09.025
Mevel, R., Draper, J.E., Lie-A-Ling, M., Kouskoff, V., & Lacaud, G. (2019). RUNX transcription factors: Orchestrators of development. Development (Cambridge), 146, 1–19. DOI:10.1242/dev.148296
Miyazono, K., Kamiya, Y., & Morikawa, M. (2010). Bone morphogenetic protein receptors and signal transduction. Journal of Biochemistry, 147(1), 35–51. DOI:10.1093/jb/mvp148
Mueller, T.D., & Nickel, J. (2012). Promiscuity and specificity in BMP receptor activation. FEBS Letters, 586(14), 1846–1859. DOI:10.1016/j.febslet.2012.02.043
Nickel, J., & Mueller, T.D. (2019). Specification of BMP Signaling. Cells, 8(12), 1579. DOI:10.3390/cells8121579
Park, S.Y., Kim, K.H., Kim, S., Lee, Y.M., & Seol, Y.J. (2019). BMP-2 gene delivery-based bone regeneration in dentistry. Pharmaceutics, 11(8), 1–23. DOI:10.3390/pharmaceutics11080393
Rahman, M.S., Akhtar, N., Jamil, H.M., Banik, R.S., & Asaduzzaman, S.M. (2015). TGF-β/BMP signaling and other molecular events: Regulation of osteoblastogenesis and bone formation. Bone Research, 3, Article 15005. DOI:10.1038/boneres.2015.5
Ruehle, M.A., Krishnan, L., Vantucci, C.E., Wang, Y., Stevens, H.Y., Roy, K., Guldberg, R.E., & Willett, N.J. (2019). Effects of BMP-2 dose and delivery of microvascular fragments on healing of bone defects with concomitant volumetric muscle loss. Journal of Orthopaedic Research, 37(3), 553–561. DOI:10.1002/jor.24225
Ruppert, R., Hoffmann, E., & Sebald, W. (1996). Human bone morphogenetic protein 2 contains a heparin-binding site which modifies its biological activity. European Journal of Biochemistry, 237(1), 295–302. DOI:10.1111/j.1432-1033.1996.0295n.x
Saraff, V., Narayanan, V.K., Lawson, A.J., Shaw, N.J., Preece, M.A., & Högler, W. (2016). A diagnostic algorithm for children with low alkaline phosphatase activities: Lessons learned from laboratory screening for hypophosphatasia. Journal of Pediatrics, 172, 181-186e1. DOI:10.1016/j.jpeds.2016.01.045
Scheufler, C., Sebald, W., Hulsmeyer, M., Hu, M., & Hülsmeyer, M. (1999). Crystal Structure of Human Bone Morphogenetic Protein-2 at 2.7 A Resolution. Journal of Molecular Biology, 287, 103–115. DOI:10.1006/jmbi.1999.2590
Sharapova, N.E., Kotnova, A.P., Galushkina, Z.M., Lavrova, N.V., Poletaeva, N.N., Tukhvatulin, A.E., Semikhin, A.S., Gromov, A.V., Soboleva, L.A., Ershova, A.S., Zaitsev, V.V., Sergienko, O.V., Lunin, V.G., & Karyagina, A.S. (2010). Production of the recombinant human bone morphogenetic protein-2 in Escherichia coli and testing of its biological activity in vitro and in vivo. Molecular Biology, 44(6), 923–930. DOI:10.1134/S0026893310060099
Tabisz, B., Schmitz, W., Schmitz, M., Luehmann, T., Heusler, E., Rybak, J., Meinel, L., Fiebig, J.E., Mueller, T.D., & Nickel, J. (2017). Site-Directed Immobilization of BMP-2: Two Approaches for the Production of Innovative Osteoinductive Sca ff olds. Biomacromolecules, 18(3):695-708. DOI:10.1021/acs.biomac.6b01407
Uday, S., Matsumura, T., Saraff, V., Saito, S., Orimo, H., & Högler, W. (2019). Tissue non-specific alkaline phosphatase activity and mineralization capacity of bi-allelic mutations from severe perinatal and asymptomatic hypophosphatasia phenotypes: Results from an in vitro mutagenesis model. Bone, 127(January), 9–16. DOI:10.1016/j.bone.2019.05.031
Vallejo, L.F., Brokelmann, M., Marten, S., Trappe, S., Cabrera-Crespo, J., Andrea Hoffmann, A., Gross, G., Weich, H.A., & Rinas, U. (2002). Renaturation and purification of bone morphogenetic protein-2 produced as inclusion bodies in high-cell-density cultures of recombinant Escherichia coli. Journal of Biotechnology, 94 (2), 185-194. DOI:10.1016/S0168-1656(01)00425-4.
Von Einem, S., Schwarz, E., & Rudolph, R. (2010). A novel TWO-STEP renaturation procedure for efficient production of recombinant BMP-2. Protein Expression and Purification, 73(1), 65-69. DOI:10.1016/j.pep.2010.03.009
Xiong, S., Zhang, L., & He, Q.-Y. (2008). Fractionation of proteins by heparin chromatography. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.), 424, 213–221. DOI:10.1007/978-1-60327-064-9_18
Yilgor, P., Tuzlakoglu, K., Reis, R. L., Hasirci, N., & Hasirci, V. (2009). Incorporation of a sequential BMP-2/BMP-7 delivery system into chitosan-based scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials, 30(21), 3551–3559. DOI:10.1016/j.biomaterials.2009.03.024
Descargas
Publicado
Cómo citar
Número
Sección
Licencia
Derechos de autor 2021 Actualidades Biológicas
Esta obra está bajo una licencia internacional Creative Commons Atribución-NoComercial-CompartirIgual 4.0.
Los autores autorizan de forma exclusiva, a la revista Actualidades Biológicas a editar y publicar el manuscrito sometido en caso de ser recomendada y aceptada su publicación, sin que esto represente costo alguno para la Revista o para la Universidad de Antioquia.
Todas las ideas y opiniones contenidas en los artículos son de entera responsabilidad de los autores. El contenido total de los números o suplementos de la revista, está protegido bajo Licencia Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional, por lo que no pueden ser empleados para usos comerciales, pero sí para fines educativos. Sin embargo, por favor, mencionar como fuente a la revista Actualidades Biológicas y enviar una copia de la publicación en que fue reproducido el contenido.
