Incorporação de Uracil DNA glicosilase / dUTPs na reação de PCR aninhada para detecção de Plasmodium falciparum e Plasmodium vivax: uma estratégia para reduzir o risco de contaminação
DOI:
https://doi.org/10.17533/udea.acbi.v42n113a06Palavras-chave:
Contaminación de ADN, Malaria, Plasmodium sp., Reacción en Cadena de la Polimerasa, Uridina trifosfatoResumo
A reação em cadeia da polimerase (PCR) é usada em pesquisas e como teste diagnóstico para confirmar a infecção por malária em amostras clínicas. Por ser um método com sensibilidade próxima a 100%, é suscetível à contaminação por amplicons, quando um grande volume de amostras é processado, aumentando o risco de falsos positivos. Este estudo avaliou a incorporação do sistema uracil DNA glicosilase (UDG)-dUTPs na reação de PCR aninhada (nPCR) para Plasmodium falciparum e Plasmodium vivax, como estratégia para prevenir a contaminação por amplicons em novas reações. O DNA da cepa P. falciparum 3D7 e uma amostra clínica confirmada com P. vivax foram utilizados em todas as reações. O efeito da substituição de dTTPs por dUTPs na reação nPCR foi avaliado e seu efeito no limite de detecção foi verificado. A ação degradante da enzima UDG foi avaliada em reações de PCR artificialmente contaminadas com amplicons. O DNA contaminante capaz de degradar uma unidade de UDG foi quantificado neste sistema. A substituição de dTTPs por dUTPs não afetou a função da Taq polimerase, no entanto, uma ligeira diminuição na sensibilidade analítica de nPCR foi observada quando dUTPs foram incorporados. Em reações contaminadas, o UDG foi capaz de degradar exclusivamente amplicons contaminantes, sem afetar a amplificação do DNA nativo. Uma unidade de UDG foi capaz de degradar completamente até 6 pg/µl de DNA contaminante. O sistema UDG-dUTPs pode prevenir a contaminação para melhorar o diagnóstico molecular na malária.
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