Simplificación de la fertilización de ovocitos durante la producción in vitro de embriones bovinos

  • Rodrigo A. Urrego
  • Ariel M. Tarazona
  • Martha Olivera A.
  • Omar Camargo

Abstract

Resumen El objetivo de este estudio fue evaluar un nuevo procedimiento de fertilización in vitro (FIV) de ovocitos bovinos, en el cual se omitió la centrifugación de los espermatozoides para los procesos de lavado y selección espermática. Dentro de cada uno de los pozos de los platos convencionales de cuatro pozos (pozos externos) se introdujo un nuevo pozo más pequeño (pozos internos) de aproximadamente 50 μl hecho en material de vidrio (0.3 mm de alto por 0.8 mm de diámetro). El procedimiento consistió en llenar los pozos interno y externo con 700 μl de medio de fertilización, hasta que el pozo interno quedara cubierto de medio, luego se depositaron 10 CCOs por pozo interno; luego 30 μl de semen previamente descongelado se depositaron en el fondo del pozo externo. Después de una hora se removió todo el contenido del pozo externo y se dejó el contenido del pozo interno con el medio y las células germinales por un periodo de incubación de 16 h. Los presuntos cigotos fueron cultivados en medio CR1aa por un periodo de siete días con un cambio de medio a las 72h. Como control, se utilizó un gradiente de Percoll 45-90% para la selección espermática. La tasa de de ovocitos divididos fue de (70.8 vs. 73.1) y la proporción de ovocitos que llegaron al estadio de morúla y blastocisto fue de (18.8 vs. 20.3), respectivamente. Los resultados obtenidos con la nueva propuesta metodológica son similares a los obtenidos con la metodología convencional (p < 0.05). Estos resultados indican que ambos métodos producen resultados similares pero la nueva propuesta metodológica permite ahorrar tiempo, es menos laboriosa, consume menos reactivos y permite reducir la manipulación de las células espermáticas con buenos efectos eventuales en el mejoramiento de los procedimientos de reproducción in vitro. Palabras clave: centrifugación de espermatozoides, embriones bovinos, fertilización in vitro. Summary This study was conducted to evaluate an in vitro fertilization (IVF) procedure that avoids the washingselection-centrifugation of spermatozoa prior to coincubation with oocytes. A special dish was constructed as follows: in the middle of each of the 4-wells of a conventional plastic dish (larger wells), another little (≈50 μl) glass dish (inner well) was placed (0.3 mm-tall x 0.8 mm in diameter), in such a way that when the larger plate was filled with 700 μl of IVF media (Fert-TALP), the inner well was also filled up to overflowing. Ten in vitro matured oocytes were set into the inner well, and 30 μl of thawed semen were placed on the bottom of the outer well. After one hour of incubation, the media from the outer well was removed, and the well with the remaining media and the germ cells, were incubated for 16 hours. Presumptive zygotes were cultured in a CR1aa media for seven days with a culture media replace at 72 h. As a control, a conventional IVF, using the classical 45-90% Percoll gradient selection, was carried out. The cleavage rates (70.8 vs. 73.1) and the proportion of oocytes reaching morula and blastocyst stages (18.8 vs. 20.3) by the "easy-IVF" were similar to the results obtained by the classical method (p < 0.05). These results indicate that the two methods yield similar results but the "easy-IVF" definitely saves time, human effort, reagents, and after all reduces the manipulation of the sperm with eventual good effects in the long run toward improving in vitro reproduction procedures. Key words: bovine embryos, in vitro fertilization, sperm centrifugation. Resumo O objetivo deste estudo foi avaliar um novo procedimento de fertilização in vitro (FIV) de oócitos bovinos, que foi omitida na centrífuga esperma lavar os processos de seleção e de esperma. Dentro de cada um dos poços pratos convencionais quatro poços (poços externa) um novo bem menor (poços internos) cerca de 50 μl fato em vidro (0,3 mm de altura por 0,8 mm de diâmetro) foram introduziu. O procedimento foi de encher poços interna e externamente com 700 μ l meio de fertilização, até que a fossa foi coberto por meios internos e, em seguida, depositadas 10 CCOs em poços internos; então 30 μl previamente descongelados sêmen foi depositado no fundo da cova fora. Depois de uma hora é retirada a todo o conteúdo da cova, e foi deixada fora da doméstica no conteúdo do bem com o ambiente e células germinativas por um período de incubação de 16 h. A alegada zygotes foram cultivados em meio CR1aa por um período de 7 dias com uma mudança no meio-72h. Como um controle, utilizado uma gradiente de Percoll 45-90% de selecção de espermatozóides. A taxa de oócitos foi dividida (70.8 vs 73.1) e da proporção de oócitos que atingiu o estádio e foi Mórula blastocisto (18.8 vs 20.3), respectivamente. Os resultados obtidos com a nova metodologia proposta são semelhantes aos obtidos com a metodologia convencional (p < 0.05). Estes resultados indicam que ambos os métodos produzem resultados semelhantes, mas a nova proposta metodológica economiza tempo, é menos trabalhoso, consome menos reativo e reduzem a manipulação de células espermáticas com bons potenciais efeitos na melhoria dos procedimentos reprodução in vitro. Palavras chave: centrifugação de sêmen, embriões bovinos, fertilização in vitro.

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Published
2009-07-08
Section
Brief communications