Detección y expresión de una proteína de unión a calmodulina en Plasmodium falciparum

Resumen

Los organismos vivos han establecido varios mecanismos con los cuales traducen las señales extracelulares a un mensaje intracelular que puede ser entendido por la maquinaria bioquímica de la célula. En eucariotes la calmodulina CaM está involucrada en estos mecanismos regulando muchos procesos celulares controlados por las vías de señalización dependientes de calcio. Para ejercer su función reguladora, la CaM interactúa con un amplio rango de enzimas y componentes de citoesqueleto, disparando respuestas bioquímicas altamente específicas que se ejercen a través de las proteínas a las cuales se une y que se conocen como proteínas de unión a calmodulina PUCaMs.

En Plasmodium falciparum se ha reportado la presencia de CaM y se sabe que el calcio juega un papel determinante en diferentes eventos del parásito; sin embargo, aun no se ha establecido el compromiso de las PUCaMs. En el grupo de bioquímica del Instituto Nacional de Salud se aislaron 9 PUCaMs mediante cromatografía de afinidad, utilizando columnas de CaM-agarosa en presencia de 0.2 mM de CaCl2 a partir de extractos proteicos de P. falciparum. Como estrategias de confirmación independientes a la afinidad, se utilizaron las pruebas de coinmunoprecipitación y revelado con CaM biotinilada, ensayos que además de corroborar la unión a calmodulina permitieron determinar exactamente cuales eran las PUCaMs del parásito. Posteriormente las PUCaMs se concentraron y se utilizaron en la producción de anticuerpos monoclonales, iniciando con una de 30 kDa. El anticuerpo monoclonal obtenido contra dicha proteína nos permitió detectar y establecer el patrón de expresión de la PUCaM durante el ciclo celular asexual del parásito. Mediante Western blot se detectó la proteína de interés en extractos del parásito como una banda a la altura de 30 kDa. Adicionalmente el anticuerpo presentó reacción cruzada con las cadenas de la espectrina sugiriendo la presencia de un epítope similar o una estructura estrechamente relacionada en ambas proteínas. La cinética de expresión reveló que esta proteína es expresada en una manera estado específica, únicamente durante los estadios tardíos de desarrollo; este patrón de expresión diferencial demuestra que la PUCaM de 30 kDa es regulada a lo largo del desarrollo del parásito.

Actualmente se está trabajando en la obtención de otros anticuerpos contra las PUCaMs restantes que nos permitan seguir caracterizando este tipo de proteínas en Plasmodium falciparum y posteriormente establecer su papel en los diferentes procesos del parásito, así como entender la fisiología de la señal de calcio en este organismo.