Queratinocitos derivados de piel humana modificados por el vector retroviral FOCH 29-NeoR

Resumen

En este protocolo se evaluará la eficiencia de la transducción mediada por el vector retroviral FOCH 29-NeoR derivado del virus de Friend; éste ha mostrado una alta eficiencia en la transducción, tanto de células madres hematopoyéticas como de otras líneas celulares. Se medirá su eficiencia de transducción en cultivos primarios de queratinocitos, derivados de biopsias de piel humana o de sobrantes de procedimientos quirúrgicos como circuncisiones, mastectomías y cirugía cosmética de pacientes que consultan el Hospital Universitario San Vicente de Paul, Hospital la María, la Clínica del Rosario y la Clínica León XIII.

Las muestras de piel se procesarán en un lapso no superior a 12 horas, se eliminará el exceso de dermis y tejido conectivo por digestión con dispasa (0.6-2.4 U/ml a 37°C) durante 1 hora. Las muestras serán lavadas con PBS, antibiótico (penicilina + estreptomicina) y se cortarán en fragmentos de 1-2 mm; después de 2-3 horas de digestión con tripsina-EDTA (0.25%) las células serán resuspendidas en KGM (Medio de crecimiento para queratinocitos) y se sembrarán a una concentración de 105 - 3x105 células por plato de 100 mm; se incubarán a 37°C, 5% CO2 con cambios de medio 2-3 veces por semana. Se harán subcultivos con el fin de expandirlos y congelar una parte de las células (banco).

Posteriormente, los queratinocitos en cultivo serán modificados con el vector retroviral anfotrópico FOCH 29-NeoR ya sea por cocultivo con la línea productora del virus Clon 26, o por infección con sobrenadante filtrado (0.45mm) producido por la misma, en presencia de polybren.

La eficiencia de la transducción se determinará mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con el ADN de las células post transducción, con cebadores específicos del gen de resistencia a la neomicina (NeoR); se incluirán tanto controles negativos (células no transducidas ) como positivos (plásmidos que contienen el gen NeoR o células de la línea productora del virus). Para demostrar funcionalmente la expresión del gen vectorizado se harán ensayos de resistencia a la G418 (500-1000 mg/ml).

Confirmar que el vector FOCH29-NeoR transluce eficientemente los queratinocitos, permitirá utilizarlo posteriormente para vectorizar genes de interés para el tratamiento de algunas enfermedades de la piel o bien factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento epidérmico (EGF) y el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), potenciadores de los procesos de epitelialización.

Este trabajo sentará las bases para el desarrollo paulatino de esta tecnología en nuestro medio.