Inactivación del cromosoma-X y BRCA1. Exploración con RNAi

  • Lina Marcela Barrera Arenas Universidad de Antioquia
  • David Aristizabal Corrales Universidad de Antioquia
  • Mauricio Camargo Guerrero Universidad de Antioquia

Resumen

La inactivación del cromosoma X es un evento epigenético sorprendente que suprime muchos genes en uno de los dos cromosomas X en los mamíferos hembras. La  erencia somática de esta inactivación depende de su mantenimiento que involucra un complejo remodelamiento de la cromatina. Hace dos décadas publicamos la primera evidencia de la existencia de dos cromosomas X activos en células de cáncer de mama (Hum Genet 55:81, 1980), observación citogenética reiterada que aún permanece inexplicada a nivel molecular. Sin embargo, el tema se ha reactivado a partir de evidencias recientes que involucran a la proteína BRCA1 con remodelación de la cromatina. Así, partiendo de estas dos observaciones, una citogenética y la otra molecular, planteamos la pregunta de la posible relación entre BRCA1 y el proceso de inactivación del X. Para investigarlo, se inicio con la abrogación de la expresión de BRCA1 en células XiXa, utilizando el mecanismo de RNA de interferencia mediado por shRNAss contra el mRNA de la proteína BRCA1. Se utilizó el kit siSTRIKEU6 Hairpin CloningSystem-Neo (Promega) que provee un vector de expresión, al que se le introdujeron secuencias de un shRNA complementario al mRNA, diseñadas a través del software siRNA-Target-Designer. Los productos de ligación psiSISTRIKE + 3 secuencias de shRNAs antiBRCA1 y una secuencia control-random, se amplificaron en DH5. De sus respectivos clones se extrajeron los plásmidos recombinantes para transfectar células XiXa mediante lipofectamina-2000. Se confirmó el silenciamiento de la proteína BRCA1 por Western blot. La secuencia Sh2, generó el mayor grado de silenciamiento, y se escogió para realizar los experimentos que apuntan a examinar la influencia del silenciamiento de BRCA1 m diada con RNAi sobre la replicación de ambos cromosomas X, y sobre la expresión de genes sinténicos que habitualmente escapan o no al mecanismo natural de inactivación. Agradecemos la co-financiación de la Universidad de Antioquia y de la Fundación Banco de la Republica (proyecto 2594). Barrido Genómico de Asociación (GWAs) a Labio/Paladar Fisurado no-sindrómico en una muestra poblacional en Colombia. Mauricio Camargo, Dora Rivera, Mauricio Arcos-Burgos Universidad de Antioquia, Grupo- GenPop, SIU-432

Las hendiduras orofaciales (OFC) son un problema mayor en salud publica ya que afectan a uno de cada 500-1000 niños a nivel mundial. Su compleja etiología muestra estar asociada a la interacción multiloci con covariantes ambientales prenatales. Los pacientes con/sin paladar fisurado no-sindrómico (NS-CL/P) son el grupo mas prevalente, y el motivo de este estudio. Hasta ahora los análisis de segregación y de patrones de recurrencia para CL/P han apoyado los modelos multigénicos y de genes de efecto mayor. Sin embargo, los análisis de mutaciones han detectado que solo el 2-6% del total de individuos con NS-CL/P poseen cambios en genes candidatos como MSX1, FOXE1, GLI2, JAG2, LHX8, SATB2, RYK1.

Objetivos: aplicar el GWAs para detectar CNVs casoexclusivos, y poner a prueba la hipótesis de que aquellos loci significativamente ligados a NS-CL/P bajo un modelo recesivo, tendrían largos trechos de homocigosis (LRH) o disminución de heterocigosis cuando se comparen pares de afectados/no- afectados en familias con NS-CL/P.

Métodos: las familias se contactaron a través de los pacientes/ probandos diagnosticados en la Clínica Noel de Medellín, Colombia. La mayoría de familias son multigeneracionales y con varias personas con CL/P. (A la fecha se han reclutado 661 pedigrees, constituidos por 2717 personas, 1925 no afectados y 792 afectados con CL/P no sindromico).

Genotipificación: se aplicó la plataforma Illumina HumanCNV370- quad con el Infinium Assay, que además de permitir el barrido genómico de SNPs, también rastrea para ~14,000 regiones adicionales de CNVs que proveen acceso a regiones hipervariables permitiendo extender el análisis a regiones subrepresentadas en otras plataformas y/o aun no incluidas en bases de datos públicas, con la ventaja de incluir megasatélites y duplicaciones segmentales con énfasis en regiones pequeñas.

Análisis: los CNVs se caracterizaron mediante en algoritmo PennCNV. Se estimaron los parametos "B-Allele- Freq" y "Log R Ratio", tomando en cuenta la relación de intensidad alélica para cada marcador, sus frecuencias, y las distancias con SNPs vecinos, a través de los softwares GenomeStudio y Golden Helix.

Resultados y conclusiones: se obtuvo un mapa completo de CNVs para no afectados y afectados con labio/ paladar fisurado no-sindrómico, y se detectaron CNVs caso-exclusivos, así como reiteración en la pérdida de heterocigosis en regiones puntuales que albergan genes candidatos de señalización y/o expresión embrionaria temprana, incluyendo regiones que armonizan con mapeos previos realizados por el grupo. Este barrido genómico ha generado abundante información que permite múltiples análisis adicionales. (Financiacion: Colciencias 111-54-82-519, Universidad de Antioquia Programa Sostenibilidad).

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Biografía del autor/a

Lina Marcela Barrera Arenas, Universidad de Antioquia
Genética de Poblaciones y Mutacarcinogénesis, Sede de InvestigaciónUniversitaria, Instituto de Biología
David Aristizabal Corrales, Universidad de Antioquia
Genética de Poblaciones y Mutacarcinogénesis, Sede de InvestigaciónUniversitaria, Instituto de Biología
Mauricio Camargo Guerrero, Universidad de Antioquia
Genética de Poblaciones y Mutacarcinogénesis, Sede de InvestigaciónUniversitaria, Instituto de Biología
Publicado
2010-12-05
Cómo citar
Barrera Arenas, L. M., Aristizabal Corrales, D., & Camargo Guerrero, M. (2010). Inactivación del cromosoma-X y BRCA1. Exploración con RNAi. Iatreia, 23(4-S), S-127. Recuperado a partir de https://revistas.udea.edu.co/index.php/iatreia/article/view/8319
Sección
Resúmenes