Separación de conidias de Paracoccidioides brasiliensis por gradientes discontinuos de Percoll

Abstract

Se ha demostrado que las conidias de Paracoccidioides brasiliensis (Pb) constituyen una de las formas naturales infectantes del hongo. Sin embargo, debido a la dificultad para obtener conidias, los estudios experimentales in vitro e in vivo han utilizado principalmente inóculos de levaduras. El presente trabajo tuvo como objetivo implementar un método para purificar conidias a partir de cultivos del hongo en su fase miceliar, hechos en medios pobres (agar-agua) que permiten la esporulación. Para la purificación se realizaron ensayos utilizando gradientes discontinuos de Percoll con densidades entre 1,138 (95%) y 1,107 (60%), preparados en PBS 0,15M y sucrosa 0,25M, a través de los cuales se centrifugaron suspensiones de micelio y conidias por 60min., 1800g a 4°C. Los mejores resultados se obtuvieron con los gradientes de 95 y 90% en sucrosa. Con el primero de ellos la pureza de las conidias estuvo entre 70,6 y 100%, con una media de 82,3 y un coeficiente de variación (CV) de 11,7. En el caso de gradientes de 90%, la pureza estuvo entre 70,4 a 92,5%, con una media de 80,6% y un CV de 9,2%. La eficiencia de recuperación fue de 4,5± 3,3 x 106 conidias/caja para gradientes de 95% y de 6,1 ± 2,2 x 106 conidias/caja para los de 90%. La viabilidad en todos los casos fue superior al 90%. Este método permite disponer de inóculos de conidias con menor contaminación de fragmentos miceliares, para así lograr un mejor control de los modelos experimentales.