Caracterización molecular de las proteínas p47phox y p40phox del sistema NADPH oxidasa mediante mutagénesis sitio dirigida

Resumen

Los neutrófilos responden a diferentes estímulos con un fenómeno conocido como “explosión respiratoria” la cual depende del sistema NADPH oxidasa. La importancia de este sistema para la actividad microbicida de las células fagocíticas es evidente en pacientes con Enfermedad Granulomatosa Crónica (EGC), los cuales sufren un incremento en la susceptibilidad a infecciones por hongos y bacterias debido a una deficiencia en la producción de agentes oxidantes por los fagocitos. El sistema NADPH oxidasa está formado por seis componentes esenciales: p40phox, p47phox, p67phox, p22phox y gp91phox. Una sexta proteína implicada en la activación del sistema es la proteína p21rac, de la familia de las GTPasas relacionadas con Ras. El centro funcional de este sistema se encuentra en el flavocitocromo b558, compuesto por las subunidades gp91phox y p22phox ubicadas en la membrana de las vesículas secretorias y gránulos específicos, las cuales aceptan electrones del NADPH citosólico y lo donan al oxígeno molecular que se encuentra en la vacuola fagocítica.

En las células en reposo, los otros tres componentes, p40phox, p47phox y p67phox, se encuentran en el citosol como un complejo. La p47phox es una proteína altamente básica que contiene dos dominios de homología 3 con las Src (SH3) y una región rica en prolinas, regiones que le permiten relacionarse con otras proteínas, de la misma manera posee entre 6 y 9 serinas en su extremo carboxilo terminal que pueden ser fosforiladas. La p67phox es una proteína de 526 amino ácidos que contiene dos dominios SH3 y una región rica en prolinas. El último componente del sistema NADPH oxidasa en ser caracterizado es una proteína de 339 amino ácidos, con un peso molecular de 40 Kda y un dominio SH3. La separación de los componentes de la NADPH oxidasa en compartimentos subcelulares distintos garantiza que esta oxidasa esté inactiva en las células en reposo. Sin embargo, durante la activación de la célula fagocítica, los componentes citosólicos se desplazan a la membrana plasmática o a la membrana del fagolisosoma donde son ensamblados.

Teniendo en cuenta que el proceso de ensamblaje de la oxidasa es altamente regulado e involucra múltiples interacciones entre cada uno de sus componentes y que un gran número de estos sitios de unión entre las proteínas han sido identificados, nuestro grupo está implementando metodologías con el objetivo de analizar in vitro el efecto que tienen ciertas mutaciones en las proteínas p47phox, p40phox y p67phox por medio de la mutagénesis sitio dirigida. Las proteínas mutadas generadas por este método nos puede dar información acerca de la estructura y función en la activación del sistema NADPH oxidasa. Se puede determinar la capacidad de las proteínas mutadas para reconstituir la producción de anión superóxido en un sistema libre de células o en líneas celulares deficientes en una de estas proteínas. Por otro lado estamos implementando el sistema de proteínas de fusión con la proteína verde fluorescente (GFP) para determinar en líneas celulares las interacciones entre las diferentes proteínas y su translocación hacia la membrana, tanto en proteínas mutadas como tipo silvestre. De esta manera es posible que estos trabajos conduzcan a esclarecer de una mejor forma las interacciones intermoleculares que ocurren en medio de estos componentes proteicos durante el proceso de ensamblaje.

 Abreviaciones: (EGC), Enfermedad Granulomatosa Crónica; GFP, green fluorescent protein; NADPH,; phox, phagocyte Oxidase; SH3, Src homology 3.