Estratégias de detección de trampas extracelulares de neutrófilos (NETs)

Abstract

INTRODUCCIÓN: la NETosis es un mecanismo celular, descrito recientemente, en el que los neutrófilos liberan una red de cromatina y proteínas granulares al espacio extracelular en respuesta a microorganismos y otras moléculas activadoras. Estas redes llamadas trampas extracelulares de Neutrófilos (NETs) son capaces de atrapar y destruir gérmenes. In vitro es posible inducir la formación de NETs usando estímulos como PMA (phorbol myristate acetate), LPS (lipopolisacarido), microorganismos y algunas citoquinas. Las NETs se visualizan por medio de microscopia de fluorescencia y se pueden cuantificar mediante espectrofluorimetría. 

MATERIALES Y MÉTODOS: 25 x104 neutrófilos aislados de sangre periférica son incubados por 30 minutos en RPMI a 37º C en 5% de CO2. Posteriormente se adiciona al medio PMA (25 nM) por un espacio de 90 minutos. Por último, se hace la tinción con intercalantes de DNA como sytox Green (2.5 μM), Ioduro de propidio (2.5 ug/ml) o Hoechst (10 μg/ml). Los platos de cultivo son leídos por espectrofluorimetría para cuantificar la cantidad de NETs y las placas son  observadas en microscopia de fluorescencia.

RESULTADOS PRELIMINARES Y CONCLUSIONES: hemos encontrado que al estimular los neutrófilos con PMA (25 nM), se observan estructuras compatibles con las NETs. Este proceso es dosis dependiente y se induce entre 60 y 120 minutos aproximadamente luego de adicionar el estímulo. Su visualización por microscopía de fluorescencia es posible mediante el uso de intercalantes de DNA como sytox Green, Ioduro de propidio y Hoechst. Hemos determinado que la cuantificación de NETs se puede llevar a cabo por espectrofluorimetría. El DNA presente en el espacio extracelular se une a Sytox Green y la emisión de fluorescencia se traduce en el porcentaje de NETs presentes.